Клещевой энцефалит

Содержание исследования:

1.   Историческая справка 
2.   Этиология и распространенность инфекции клещевого энцефалита 
2.1. Возбудитель инфекции и его переносчики в природе 
2.2. Распространенность клещевого энцефалита 
3. Проявления клещевого энцефалита и его последствия 
3.1. Острая инфекция 
3.2. Хроническая инфекция 
4. Молекулярная биология вируса клещевого энцефалита 
4.1. Морфология и структурно-функциональные характеристики флавивирусов 
4.2. Организация генома ВКЭ и экспрессия структурных и неструктурных вирусных белков 
4.3. Структура и функции белка Е 
4.4. Репликативный цикл флавивирусов 
5. Молекулярно-генетическая неоднородность и патогенность вируса клещевого энцефалита 
5.1. Генотипы и серотипы вируса
 

 

Историческая справка

Открытие вируса клещевого энцефалита и начало всестороннего изучения этиологически связанной с этим вирусом нейроинфекции клещевого энцефалита составляют замечательные и одновременно драматические эпизоды истории отечественной медицинской вирусологии. Эпидемия весенне-летнего клещевого энцефалита была подтверждена и ее комплексное исследование начато на Дальнем Востоке экспедициями Наркомздрава бывшего СССР в 1937–1939 гг. В составе экспедиций вместе с вирусологами и инфекционистами из центра работали местные клиницисты-неврологи, хорошо знакомые с характерной нейропатологией в регионе. 

Из мозга и ликвора умерших от тяжелой острой формы энцефалитных больных, в анамнезе которых часто упоминался укус лесного клеща, вирусологами был выделен и впервые охарактеризован ранее неизвестный вирус клещевого энцефалита (ВКЭ). Немедленно были начаты исследования роли клещей в передаче природно-очаговой инфекции, пути циркуляции вируса и его природного резервуара. По единой программе комплексно изучались этиология, эпидемиология, клиника, иммунология и патоморфология ВКЭ-инфекции, началась разработка методов её диагностики, лечения и вакцинопрофилактики.

Во время этих работ среди немалого числа тяжелых больных и умерших от клещевого энцефалита были и сотрудники научных экспедиций. В 1937 г. при вскрытии умершего больного один из первооткрывателей ВКЭ М.П. Чумаков заразился клещевым энцефалитом и перенес энцефалополиомиелит. Острая инфекция со временем перешла в хроническую болезнь, которая протекала пожизненно до 1993 г. Еще во время экспедиции М.П. Чумаков показал возможность культивирования ВКЭ в тканевых фрагментах, и позже, в 1944 г., также впервые выделил вирус из крови хронического больного клещевым энцефалитом (кожевниковской эпилепсией). Несмотря на тяжелую болезнь с поражениями слуха и шейной, правой плечевой зоны мозга, а в дальнейшем в конце 80-х годов с прогрессированием двигательных нарушений, академик М.П. Чумаков сохранял огромную трудоспособность и высокий интеллект. По его завещанию было проведено уникальное посмертное исследование его мозга в отношении хронического клещевого энцефалита, протекавшего десятилетиями после первоначального инфицирования вирусом с манифестациями острой инфекции.

Как следует из воспоминаний участников экспедиций в печати, жертвы тогда приносились не только вновь открытой таежной инфекции. В разгар работ руководитель первой экспедиции профессор Л.А.Зильбер, руководитель отряда А.Д. Шеболдаева и эпидемиолог Т.А. Сафонова были арестованы властями по ложному обвинению, что экспедиция тайно распространяла японский энцефалит на Дальнем Востоке.

В Европе клещевой энцефалит впервые был диагностирован в Чехословакии в 1948 г., и инфекция стала известна под названием центрально-европейский энцефалит. В отличие от Европы клещевой энцефалит в России назывался русским весенне-летним эпидемическим энцефалитом. Со временем, из-за общности этиологического источника, за этой широко распространенной инфекцией повсеместно утвердилось общее название клещевой энцефалит. Успешное лечение и изучение клинических особен­ностей клещевого энцефалита в течение многих лет проводились А.Г. Пановым, А.Н. Шаповалом, А.А. Смородинцевым, А.П. Иерусалимским и др. В изучение молекулярной биологии, генотипирование ВКЭ, в исследования глубоких связей между гетерогенностью генома природного клещевого пула вируса и вирулентностью, патогенезом, клиническими и эпидемиологическими особенностями природно-очаговой нейровирусной инфекции клещевого энцефалита, а также в разработку ПЦР-анализа возбудителя инфекции значительный вклад был сделан благодаря расшифровке первичной нуклеотидной последовательности полного генома и аминокислотной последовательности полипротеина ВКЭ, впервые проведенной А.Г. Плетневым, В.Ф. Ямщиковым и 
В.М. Блиновым. Другим значительным событием в этих исследованиях стали получение и изучение C.W. Mandl, F.X. Heinz, C. Kunz, Н. Holzmann, Е.К. Прессманом, Н.А. Цехановской, Л.Э. Матвеевым, А.А. Кущ и др. авторских серий моноклональных антител к основным антигенам этого вируса и применение их в качестве лабораторного инструмента высокого разрешения для исследований иммуногенных, патогенных и других функциональных свойств структурных и неструктурных белков ВКЭ, для диаг­ностики инфекции.

Дальнейшее изучение клеточно-гуморального иммунитета, сложного иммуно- и нейропатогенеза висцерально-невральной инфекции и их связи с генетической неоднородностью возбудителя инфекции и наследуемыми особенностями системы иммунитета пациента наравне с современными клиническими исследованиями острого и хронического клещевого энцефалита составляют научную основу новых разработок методов и средств профилактики, диагностики и лечения этой актуальной для здравоохранения природно-очаговой нейровирусной инфекции.

Этиология и распространенность инфекции

2.1. Возбудитель инфекции и его переносчики в природе

Клещевой энцефалит или, по международному классификатору заболеваний МКБ-10, энцефалит весенне-летнего типа (таежный) — вирусная инфекция, поражающая оболочку, серое и белое вещество и другие отделы головного и спинного мозга ЦНС, корешки спинномозгового нерва и периферические нервы, приводящая к развитию парезов и параличей. При клещевом или алиментарном заражении вирусом входными воротами организма человека служат кожа и подкожная клетчатка или клетки эпите­­лия пищеварительного тракта откуда вирус распространяется в организме по кровеносным, лимфатическим и (или) невральным путям, инфицирует клетки крови, органы иммунной системы, другие внутренние органы и достигает мозга, который служит местом длительного размножения вируса и основным центром локализации патологического очага нейроинфекции. Клинически клещевой энцефалит, как правило, развивается в острой циклической форме с выздоровлением, однако, иногда со временем может трансформироваться в хроническую инфекцию. Не исключается развитие инфекции и в первично-хронической форме. Тяжелые осложнения острой инфекции (это в первую очередь территориально относится к Дальнему Востоку России) часто могут завершиться параличом и летальным исходом. Хроническая инфекция клещевого энцефалита с поражениями мозга протекает годами или пожизненно.

Природно-очаговая инфекция клещевого энцефалита этиологически связана с вирусом клещевого энцефалита из семейства Flaviviridae, экологически относящимся к арбовирусам, переносимым членистоногими. Семейство вирусов Flaviviridae теперь выделено из семейства Togaviridae и состоит из трех родов: флавивирусов ( Flavivirus), пестивирусов ( Pestivirus) и вирусов гепатита С и G ( Hepacivirus) [40, 41]. Эти три группы вирусов, хотя имеют различные биологические свойства и не обладают серологической перекрестной реактивностью, похожи и родственны между собой с точки зрения морфологии вирионов, организации вирусного генома и предполагаемой стратегии репликации геномной РНК. Все три рода семейства флавивирусов одинаково характеризуются инфекционной геномной РНК, сходной локализацией генов структурных белков на 5’-конце геномной РНК, отсутствием специализированных геномных РНК, кодирующих белки вирионов, и образованием единого полипротеина-предшественника. 

ВКЭ в числе тесно родственного антигенного комплекса вирусов клещевого энцефалита относится к флавивирусам и чаще всего переносится клещами вида I. persulcatus и I. ricinus. В некоторых очагах ВКЭ переносится клещами H. concinna, D. silvarum, D. pictus и др. Считается, что еще до 14 видов клещей являются носителями вируса в природе, но их эпидемическая роль невелика. Основным резервуаром вируса в природе являются его главные переносчики, иксодовые клещи. Врожденная инфици­рованность клещей поддерживает постоянный уровень вирусофорности этих насекомых. Дополнительным природным резервуаром вируса cлужат прокормители инфицированных клещей: многочисленные грызуны (полевая мышь, бурундук, заяц и др.), другие дикие и домашние животные, птицы. В природе вирус поддерживается постоянной циркуляцией по замкнутой цепи: клещи — животные-прокормители — клещи. Инфицирование человека для ВКЭ является биологически тупиковым направле­нием, поскольку вирус дальше не передается к другому организму и выходит из природной циркуляции.

Для клещевого энцефалита характерна строгая весенне-летняя сезонность начала заболевания, связанная с сезонной активностью переносчиков. В ареале I. persulcatus заболевание приходится на весну и первую половину лета, май–июнь месяцы, когда наиболее высока биологическая активность этого вида клещей. Однако, как утверждается [23], на юге Дальнего Востока свежеслинявшим имаго из нимф I. persulcatus необязательна генетически запрограммированная поведенческая диапауза, которая способствует сезонному затуханию активности природного очага с этим носителем вируса в других регионах страны. Для клещей вида 
I. ricinus отмечается подъем биологической активности дважды за сезон, и в ареале этого клеща характерны 2 пика сезонной заболеваемости клещевым энцефалитом: весной (май–июнь) и в конце лета (август–сентябрь). Инфицирование человека ВКЭ происходит во время кровососания голодных вирусофорных клещей. Кровососание самки клеща продолжается много дней, и при полном насыщении она увеличивается в весе 80–120 раз. Кровососание самцов длится обычно несколько часов и иногда остается незамеченным. Передача вируса клещевого энцефалита может происходить в первые минуты присасывания высоковирусофорного клеща к человеку. Удаление клеща при сохранении «цементирующей пробки» из содержащей вирус слюны клеща в коже человека, по-видимому, полностью не устраняет передачу инфекции. 

В одном высоковирусофорном клеще может содержаться преизбыточная доза возбудителя инфекции — до 1010вирусных частиц, из числа которых попадание в кровь человека одной миллионной доли вирусного пула может быть достаточно для развития инфекции. Численность клещей во многих очагах Дальнего Востока и Сибири в среднем достигает 50–70 экз. на 1 км пешеходного маршрута, при индивидуальной зараженности (вирусофорности) клещей в естественных (диких) природных очагах от 2 до 15%. Уровень вирусофорности отдельного клеща зависит от его возраста и степени напитанности. Максимальное содержание вируса устанавливается у клещей предельных физиологических возрастов. Низкий уровень вирусофорности у клеща наблюдается в фазе перехода его к активному состоянию. Доля клещей с высоким содержанием вируса среди напитавшихся особей значительно выше, чем у голодных сородичей. На основании этого феномена предполагается возможность ускоренного размножения вируса во время и после питания клеща. Концентрация вируса в I. persulcatus, напитавшихся на больных мышах, непрерывно возрастает, достигая максимума к 40 дню. За этот период количество вируса возрастает в 1000 раз. В отличие от очагов инфекции в таежных территориях, в антропургических очагах ВКЭ-инфекции зараженность клещей вирусом достигает высоких показателей: 24,5% — в Пермской области; 34,7% — в Кировской области; 57,8% — в Новосибирской области. При этом вирусофорность клещей по непонятной причине подвержена иногда очень резким межгодовым колебаниям в 2–3 раза [1]. 

Типичными ландшафтами природных очагов инфекции оказываются лиственные и смешанные хвойно-лиственные леса с выраженным подлеском и высоким травостоем, пойменные луга по берегам рек, берега озер и прудов, лесные просеки, придорожная растительность, лесные тропинки, создающие условия для частого нахождения прокормителей клещей. Прокормителями половозрелых клещей служат крупные виды животных, а для нимф и личинок — мелкие мышевидные грызуны.

Заболевание в Европе и Сибири протекает в более легкой форме, чем в восточной части ареала, особенно на Дальнем Востоке. Это дало основание впервые различить западный и восточный типы клещевого энцефалита и, соответственно, их возбудителей. Возбудитель инфекции повсеместно принадлежит к одному виду вируса комплекса клещевого энцефалита флавивирусов и, тем не менее, клещевой пул вируса на каждой территории, как стало известно со временем, состоит из смеси штаммов, различаю­щихся генетически и серологически. Штаммы ВКЭ варьируют и по вирулентности, однако, долго не было убедительных данных по корреляции между вирулентностью и антигенными особенностями вируса. Некоторыми исследователями отмечалась большая разница в патогенности и антигенных свойствах штаммов вируса, выделенных из I. persulcatus и I. ricinus. Другие не обнаруживали строгой зависимости между географией очага, видовыми различиями переносчиков и циркуляцией определенных вариантов вируса и их патогенностью [2]. При этом известно, что летальность в Европейской части России в разные годы до последнего времени исчислялась в 1–3%, а на Дальнем Востоке роковые исходы наступали у 12–25% заболевших клещевым энцефалитом. Более того, широко известны низковирулентный вирус из комплекса вирусов клещевого энцефалита Лангат, аттенуированный культуральный штамм Еланцев ВКЭ, кандидаты для производства живых вакцин в прошлом, производственный штамм 205 для получения инактивированной вакцины и выскопатогенный дальневосточный штамм Софьин ВКЭ и др., выделенные в разных местах циркуляции вируса в разное время.

Заражение человека клещевым энцефалитом происходит не только при укусе клещами. Также наблюдается алиментарный путь заражения при употреблении сырого, содержащего вирус молока инфицированных коз и коров. Однако, в настоящее время доля этого пути в заражении людей, по сравнению с трансмиссивной передачей ВКЭ-инфекции, незначительна. 

2.2. Распространенность клещевого энцефалита

Инфекция клещевого энцефалита распространена по всей лесной и лесостепной умеренной климатической зоне Евразийского континента. Природные очаги этой инфекции имеются во всех странах западной, центральной, восточной и отчасти северной Европы, в частности, на Британских островах, во Франции, Германии, Швеции, Австрии, Чехии, Словакии, Венгрии, Польше, прибалтийских странах. В Российской Федерации, где заболевание широко распространено, высокоэндемичными районами являются средний и южный Урал, юг Западной и Восточной Сибири, Дальний Восток (Приморский край). Очаги клещевого энцефалита распространены в Монголии и в северных провинциях Китая. Самый восточный природный очаг клещевого энцефалита выявлен на острове Хоккайдо в Японии. Совсем недавно, в 1995 г., там был диагностирован первый случай тяжелого клещевого энцефалита. На рис. 1 представлена карта повсеместного распространения вируса клещевого энцефалита с указанием раздельных зон, образуемых двумя основными видами клещей-переносчиков этой инфекции [43]. Географические зоны распространения клещей 
I. persulcatus и I. ricinus на этой карте достаточно хорошо совпадают (за исключением Кавказа, Крымского и Апеннинского полуостровов, части Западной Европы и островов Великобритании) c картами распространения этих клещей, ВКЭ и заболеваемости клещевым энцефалитом, опубликованными ранее А.Н. Шаповалом в 1980 г. [53] и Э.И. Коренбергом и Ю.В. Ковалевским в 1981 г. [52]. Отсюда можно делать вывод о расширяющемся ареале распространения иксодовых клещей, носителей ВКЭ, и, по-видимому, соответствующем расширении территорий заболеваемости клещевым энцефалитом в мире в последнее время.

Показатель заболеваемости клещевым энцефалитом на 100 тыс. населения в России постоянно растет в течение многих лет и достиг величины 6,7 в 1999 г. Однако, средний показатель по стране мало что говорит о высоком уровне распространенности инфекции в некоторых регионах страны. Во многих высокоэндемичных районах этот показатель в 1998 г. был равен: в Республике Удмуртия — 53,5, в Томской области — 39,2, в Красноярском крае — 37,0, в Новосибирской области — 19,6, в Иркутской области — 12,5, в Приморском крае — 9,8. Всего в 1998 г. в Российской Федерации было зарегистрировано 7520 больных клещевым энцефалитом, и из них у 118 человек наступил летальный исход. Основная масса заболеваний приходится на Уральский, Западно-Сибирский и Восточно-Сибирский регионы. В этих регионах регистрируется 93% всех случаев заболевания клещевым энцефалитом в Российской Федерации. В последнее время заболевания клещевым энцефалитом стали выявляться и среди населе­ния ранее благополучных по этой инфекции Пензенской, Ярославской, Магаданской, Камчатской областей и других территорий. Впервые зарегистрированы больные клещевым энцефалитом в Московской, Ивановской областях [26]. Численность хронических больных клещевым энцефалитом официально до сих пор не регистрируется.

Из общего числа заболевших клещевым энцефалитом до 
75–80% больных составляют жители городов, заражение которых происходит в антропургических очагах (пригородной зоне) во время поездок по бытовым причинам, связанным со сбором грибов, ягод и работой и отдыхом на природе, дачных участках. Присасывание клещей на человека может происходить не только в лесу, но и в домашних условиях. Клещи заносятся в дом на рабочей одежде, с домашними животными, букетом полевых цветов и т.д. Отмечается переползание клещей среди пассажиров городского транспорта. В последнее время рост заболеваемости клещевым энцефалитом в России связан, возможно, не только с ростом численности неиммунного населения городов, часто контактирующего с природой, а также в какой-то степени объясняется и ростом показателей зараженности клещей вирусом. Имеется предположение о том, что рост заболеваемости клещевым энцефалитом может быть связан также с ростом вирулентности клещевого пула ВКЭ в отдельных очагах инфекции.

3. Проявления клещевого энцефалита и его последствия

3.1. Острая инфекция [2, 3, 17, 18, 53]

Инкубационный период при первичном инфицировании ВКЭ составляет 8–23 дня (чаще 10–12 дней). Изредка наблюдаются продромы: слабость, недомогание, головная боль, тошнота, нарушения сна. Отмечаются скоропреходящая слабость в конечностях, мышцах шеи, онемение кожи лица и шеи. Клинические проявления клещевого энцефалита многообразны, течение вариабельно. Болезнь часто начинается остро, с озноба и повышения температуры тела до 38–40°С. Лихорадка длится от 2 до 10 дней. Появляются общее недомогание, резкая головная боль, тошнота и рвота, разбитость, утомляемость, нарушения сна. В остром периоде отмечаются гиперемия кожи лица, шеи и груди, слизистой оболочки ротоглотки, инъекция склер и конъюнктив. Беспокоят боли во всем теле и конечностях. Характерны мышечные боли, особенно значительные в группах мышц, в которых в дальнейшем обычно возникают парезы и параличи. Иногда им предшествуют онемение, парестезии и другие неприятные ощущения. С момента начала болезни может возникать помрачнение сознания, оглушенность, усиление которых может достигать степени комы. Обычно характерна разной степени оглушенность (сопор). Тем не менее болезнь часто протекает в легких, стертых формах с коротким лихорадочным периодом.

В типичных случаях острый период клещевого энцефалита продолжается 6–8 дней, но иногда — от 3 до 14 дней. Нередко в месте присасывания клещей появляются разного размера эритемы. Однако, так называемая мигрирующая кольцевая эритема часто является клиническим маркером другой инфекции — клещевого боррелиоза или болезни Лайма, также переносимой клещами. У больных клещевым энцефалитом отмечается снижение секреторной функции желудка, антитоксической, поглотительно-экскреторной, углеводной, белокобразующей функций печени. Наблюдается лихорадочная альбуминурия. В периферической крови отмечается умеренный лейкоцитоз и увеличенная СОЭ. 

С первых дней течение острого клещевого энцефалита носит токсико-инфекционный характер. Симптоматика складывается из трех основных синдромов: общего инфекционного, менингеального и очагового поражения нервной системы. Несмотря на многообразие проявлений острого периода клещевого энцефалита, в каждом отдельном случае можно выделить ведущий синдром болезни. Исходя из этого, а также учитывая выраженность и стойкость неврологических симптомов, выделяют три основные клинические формы болезни: лихорадочную, менингеальную и очаговую менингоэнцефалитическую. Дополнительно могут диагностироваться менее распространенные полиомиелитическая и полирадикулоневротическая формы, утяжеление клинической картины заболевания, особенно очаговых форм болезни с появ­лением крайне тяжелых синдромов многоуровневого поражения ЦНС в виде энцефало-полиоэнцефаломиелитического и др. 

Лихорадочная форма болезни характеризуется благоприятным течением с быстрым выздоровлением. Продолжительность лихорадки — 3–5 дней. Основными клиническими признаками ее являются токсико-инфекционные проявления: головная боль, слабость, тошнота при слабовыраженной неврологической симптоматике. Показатели ликвора — тканевой жидкости, которая омывает головной и спинной мозг в пределах гематоэнцефалического барьера, — без отклонения от нормы. 

Менингеальная форма является наиболее часто выявляемым проявлением клещевого энцефалита. Больные жалуются на сильную головную боль, усиливающуюся при малейшем движении головы, головокружение, тошноту, однократную или многократную рвоту, боли в глазах, светобоязнь. Больные вялы и заторможены. Определяется ригидность мышц затылка, симптомы Кернига и Брудзинского. Менингеальные симптомы держатся на протяжении всего лихорадочного периода. Иногда они проявляются и при нормальной температуре. В ликворе определяется умеренное повышение содержания лимфоцитов, повышение концентрации белка. Внутричерепное давление повышено. Изменения в спинномозговой жидкости, возникшие в остром периоде болезни, могут сохраняться длительное время, даже в период выздоровления. Длительность лихорадки — 7–14 дней. Исход всегда благоприятный. 

Менингоэнцефалитическая очаговая форма клещевого энцефалита протекает тяжело и дает частую летальность. Больные вялы, заторможены, сонливы, жалуются на сильную головную боль, тошноту и рвоту. Выражены ригидность мышц затылка и симптомы Кернига и Брудзинского. Нередко наблюдаются бред, галлюцинации, психомоторное возбуждение с утратой ориентировки на месте и во времени. Могут быть эпилептиформные припадки. Судороги повторяются несколько раз в сутки, иногда развивается эпилептический статус. При менингоэнцефалитической форме характерно появление гемипарезов, подкорковых гиперкинезов, стволовых расстройств, а также очаговых поражений черепных нервов: III, IV, V и VI пар, несколько чаще VII, IX, X, XI и XII пар. Позднее может развиться кожевниковская эпилепсия, когда на фоне постоянного гиперкинеза развиваются общие эпилептические припадки с потерей сознания. При исследовании спинномозговой жидкости в остром периоде отмечается лимфоцитоз и повышенное содержание белка. 

Таким образом, при тяжелой энцефалитной форме болезни ведущие очаговые симптомы поражения ЦНС выявляются на фоне общемозговых и токсико-инфекционных проявлений. После острого клещевого энцефалита очаговой формы период выздоровления длительный, до 2 лет. Развившиеся атрофические параличи мышц восстанавливаются частично. 

Клинически особый вариант развития острой инфекции представляет клещевой энцефалит с двухволновым течением. Болезнь начинается остро ознобом, появлением головной боли, тошноты, рвоты, головокружения, болей в конечностях, нарушением сна, анорексией и наличием характерной двухволновой лихорадки. Первая лихорадочная волна продолжается 3–7 дней, характеризуется легким течением. Отмечаются слабовыраженные оболочечные симптомы без поражения черепно-мозговых нервов. Изменения в ликворе не определяются. На фоне интоксикации отмечаются вегетативные расстройства. В периферической крови — лейкопения и увеличенная СОЭ. За первой волной следует период апирексии, длящийся 7–14 дней. Вторая лихорадочная волна начинается так же остро, как и первая, температура тела поднимается до высоких значений. Больные вялы, заторможены, появляются тошнота, рвота, легкие менингеальные и очаговые симптомы поражения ЦНС. В периферической крови — лейкоцитоз, повышается содержание белка и сахара. Это качественно новая фаза болезни, и она всегда протекает тяжелее, чем первая, и длится дольше. В разные годы рецидивы лихорадочных состояний возникали на Дальнем востоке у 6–9% заболевших, в Западной Сибири — у 15–22%, в районах Урала — у 28–50% [3, 18]. Наиболее характерные клинические особенности этого варианта клещевого энцефалита — двухволновое течение менингоэнцефалита с вполне благоприятным исходом, без наслоения очаговых двигательных поражений. Множественные случаи легких заболеваний с выраженным менингеальным синдромом и легкими энцефалитическими поражениями были выявлены и изучены в Ленинградской области и Республике Удмуртия в 50–70-х годах прошлого века. С учетом характерных клинических особенностей заболевание было названо А.А. Смородинцевым двухволновым менингоэнцефалитом и выделено как самостоятельный клинико-нозогеографический вариант клещевого энцефалита [53].

А.П. Иерусалимский в своем руководстве для врачей [1] клиническую классификацию острого периода клещевого энцефалита представляет в виде следующих семи форм: лихорадочная; менингеальная; менингоэнцефалитическая (очаговая или диффузная); полиоэнцефалитическая; полиоэнцефаломиелитическая; полиомиелитическая; двухволновое течение (с указанием формы второй волны). По мнению автора, по клиническим параметрам можно достаточно четко разделить лихорадочную форму и формы с поражением оболочек и вещества мозга. Эти последние уже менее четко можно разделить на менингеальную форму и очаговые формы. А вот все очаговые формы дифференцируются между собой очень трудно, в какой-то степени условно, по ведущему, наиболее функционально значимому синдрому. 

У подавляющего большинства первично инфицированных возникают инаппарантная, субклиническая или стертая формы клещевого энцефалита. На территории Приморского края у каждого четвертого укушенного клещом выявляется инфекция клещевого энцефалита без клинических проявлений в виде продолжительной антигенемии ВКЭ в лейкоцитах и в объеме периферической крови [23]. Это основной путь «проэпидемичивания» и образования иммунитета у коренного местного населения эндемичных районов. Иногда вовремя не выявленные формы инфекции могут завершаться длительным вирусоносительством, которое может служить причиной редкого возникновения и развития так называемой первично-прогредиентной и, по-видимому, затем — первично-хронической инфекции клещевого энцефалита. 

Выздоровление после перенесенного острого клещевого энцефалита происходит в зависимости от формы проявления инфекции, ее тяжести. Изменения внутренних органов полностью исчезают в отдаленные сроки выздоровления. 

3.2. Хроническая инфекция [1, 14, 53]

Клещевой энцефалит относится к группе острых циклических инфекций, наделенных выраженной способностью к полному освобождению от возбудителя при выздоровлении, с преимущественным формированием пожизненного иммунитета у перенесших не только манифестную, но и бессимптомную форму инфекции. Однако, у некоторых больных формирование очагового синдрома выявляется в более поздние сроки болезни спустя недели или даже месяцы после снижения температуры до нормального уровня, в периоде реконвалесценции. В подобных случаях клещевой энцефалит приобретает прогредиентный характер. В спинномозговой жидкости продолжают удерживаться изменения воспалительного характера. При исследовании крови также отмечаются умеренное увеличение СОЭ, небольшой лейкоцитоз, обычно со сдвигом ее формулы в сторону абсолютного и относительного лимфоцитоза. У части больных прогредиентная инфекция, как и в случае длительного бессимптомного вирусоносительства, постепенно трансформируется в хронический клещевой энцефалит. 

Представления о хроническом клещевом энцефалите обоснованы длительной персистенцией ВКЭ у лиц, страдающих явными симптомами этой инфекции в течение ряда лет, десятилетий или пожизненно. К этим лицам часто относятся больные с клиническим диагнозом гиперкинетический синдром, кожевниковская эпилепсия, боковой амиотрофический склероз, эпидемический энцефалит, арахноэнцефалит, сирингомиелия, прогрессирующий полиэнцефаломиелит и др. Персистенция ВКЭ при этих недугах может устанавливаться иммуноферментным анализом вирусного антигена или прямым выделением реплицирующегося вируса на культуре клеток. Однако, наиболее надежным способом выявления хронической инфекции клещевого энцефалита является 
ПЦР-анализ вирусной РНК в исследуемых образцах крови или ткани пациента.

По клиническим данным, частота трансформации в хроническую инфекцию составляет 3–11% к общему числу заболеваний острым клещевым энцефалитом. Однако, в некоторых очагах инфекции в частоте трансформации острого энцефалита в хронический могут быть более значительные отклонения в ту или иную сторону.

4. Молекулярная биология вируса клещевого энцефалита 

4.1. Морфология и структурно-функциональные 
характеристики флавивирусов 

Возбудитель острого и хронического клещевого энцефалита — ВКЭ — как и вирионы всех флавивирусов, имеет сферическую форму диаметром до 50–60 нм, покрытую гликопротеиновой оболочкой. Внутри внешней оболочки размещается вирусный капсид — геномный нуклеопротеиновый комплекс, покрытый коровым белком диаметром около 30 нм. В своем составе вирусная частица содержит 68% белка, 8% РНК, 17% липидов и 9% углеводов.

Неионные детергенты, такие, как тритон-Х, солюбилизируют оболочку вируса, удаляя все белки оболочки; дезоксихолат натрия снимает только бислойную мембрану внешней оболочки, оставляя коровый белок ассоциированным с нуклеокапсидом вируса. Обработка протеазами выявляет, что якорная часть гликопротеина оболочки вируса утоплена в липидном бислое. Оболочка флавивирусов защищает геном вируса от внутриклеточных протеаз, а раздетый нуклеокапсид деградируется рибонклеазами. Во внешней среде в составе мозговой суспензии на физиологическом растворе полностью собранная частица ВКЭ сохраняет жизнеспособность при комнатной температуре до 10 дней. Вирус устойчив в кислой среде, в частности, в составе желудочного сока; вирус в крови или его суспензия в белковом растворе инактивируются при 56°С в течение 30 мин. Кипячение убивает вирус в течение 2–3 мин. В глубоко замороженном виде или лиофилизированном состоянии в вакууме вирус сохраняет жизнеспособность многие годы. Благодаря бислойной липидной природе оболочки вирус чувствителен к эфиру, растворам лизола, спиртам.

Геном флавивирусов в составе нуклеокапсида представлен одной молекулой однонитчатой РНК положительной полярности общей длиной около 11 тыс. нуклеотидов, которые кодируют полипептидную цепь длиной 3,4–3,6 тыс. аминокислотных остатков (а.о.). Вирусная РНК cодержит 7-метилгуанозиновый кэп на 5’-конце. Геномная РНК служит в качестве мРНК для внутриклеточного синтеза вирусных белков. Для сборки зрелого флавивируса синтезируются 3 вирусных структурных белка: капсидный белок С, мембранный белок М и поверхностный белок Е. Незрелые внутриклеточные вирусные частицы содержат гликозилированный белок-предшественник рreM. Кроме того, в геноме флавивирусов закодированы неструктурные белки NS1-NS5, вирусная РНК-полимераза, которые обнаружены в инфицированной клетке и участвуют в репликации вируса. В геноме все белки закодированы последовательно в виде одной открытой рамки считывания. Индивидуальные белки вируса образуются в результате ко- или посттрансляционного расщепления единого вирусного полипротеина-предшественника протеазами вирусного или клеточного происхождения.

В репликативном цикле геномная РНК является инициатором инфекционного процесса и служит матрицей для создания дочерних копий.

4.2. Организация генома ВКЭ и экспрессия структурных и неструктурных вирусных белков

Нуклеотидная последовательность всего генома ВКЭ и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса расшифрованы Плетневым с соавторами [19]. На рис. 2 представлена линейная генетическая карта вируса с указанием кодируемых генов всех структурных и неструктурных белков и концевых нетранслируемых областей генома ВКЭ штамма Софьин. Этот штамм вируса выделен от больного на Дальнем Востоке еще в 1937 г., прошел несколько десятков пассажей на лабораторных животных и пермиссивных клетках. Широко известен как прототипный штамм регионального дальневосточного генетического субтипа или антигенного серотипа ВКЭ.

Немного позже были расшифрованы полная нуклеотидная последовательность генома ВКЭ западного штамма Neudoerfl (Найдорф) [25], дальневосточного штамма 205 [30] и другого вируса из антигенного комплекса ВКЭ — вируса Повассан [73].

Длина одноцепочечной РНК генома ВКЭ штамма Софьин составляет 10477 нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов содержит единственную открытую рамку считывания белка (поз. 127–10363), кодирующую 3412 а.о. полипротеина. С 5’-конца генома 126 нуклеотидов предшествуют инициирующему транскрипцию кодону AUG; затем следует открытая рамка считывания полипротеина-предшественника всех структурных и неструктурных белков вируса длиной 10236 нуклеотидов. В другом конце полинуклеотидной последовательности геномной РНК представлены UAA-стоп кодон и 112 нуклеотидов её 3’-нетранслируемой области. 

Первым с N-концевой части полипротеина ВКЭ находится нуклеокапсидный кор-белок С, состоящий из 111 а.о. Молекулярная масса белка С равна 12108 Da. При сборке вируса он вместе с геномной РНК образуют центральную структурную компоненту нуклеокапсида. Коровый белок обогащен остатками основных аминокислот: доля остатков аргинина и лизина, по-видимому, необходимых для нейтрализации зарядов на РНК при ее упаковке в нуклеокапсид, составляет 21,4%. Следующим от N-конца фрагментом полипротеина, выщепляемым протеазами, является гликопротеин preM-полипептид длиной 168 а.о. PreM является только предшественником в синтезе вирионного бел-
ка М, его нет в составе зрелого вириона в крови, не удается обнаружить его и в зараженных вирусом клетках. Мембранный белок М, содержащийся в составе оболочки зре­лого вируса, представлен 75 остатками аминокислот, имеет молекулярную массу 8209 Da. В С-концевой части белка находятся два гидрофобных участка, разделенных остатком аргинина. Подобные последовательности имеются в белках М всех представителей флавивирусов. По-видимому, они обеспечивают этим белкам трансмембранную локализацию и важны для посттрансляционной модификации. 

Следующим отщепляемым от предшественника полипептидом является наиболее важный поверхностный вирионный бе-лок Е. Полипептидная цепь белка Е, включающая 496 а.о. с молекулярной массой 53680 Da, заканчивается двумя гидрофобными участками, вероятно, служащими трансмембранным «якорем» белка. Белок Е слабоосновный, так как 47 остатков аспарагина и глутаминовой кислоты приходятся на 50 остатков основных аминокислот. Считается, что процессинг полипротеина между белком Е и неструктурным белком NS1 осуществляет связанная с мембранами аппарата Гольджи протеиназа. Структура сайта протеолиза между этими белками высококонсервативна у всех флавивирусов. С учетом вклада гликозилирования (2 % от массы белка) молекулярная масса гликопротеина Е составляет 
55000 Da. В вирионном белке Е гликозилирование происходит только по одному месту (поз.154 а.о.) полипептидной цепи. Нуклеотидная последовательность генов структурных белков ряда флавивирусов была опубликована ранее [20, 21]. 

Расщепление полипротеинов флавивирусов протеиназой со специфичностью к последовательности Val-X-Ala, расположенной на расстоянии (–3)–(–1) от места гидролиза, обеспечивает формирование N-концов белков NS2A и NS4B. По мнению авторов [19], кроме такого типа протеолиза полипротеинов флавивирусов формирование N-концевых последовательностей белков NS3, NS4A и NS5 осуществляет, по-видимому, вирусспецифическая протеиназа по последовательности, обогащенной остатками ос­новных аминокислот, которым предшествуют протяженные гидрофобные участки полипротеинов. Функцию вирусспецифической протеиназы могут, вероятно, выполнять белки preM или NS1, так как в их составе присутствуют последовательности Cys-Trp, часто встречающиеся в активных центрах тиоловых протеиназ. Учет этих двух типов гидролиза полипротеинов флавивирусов приводит к локализации семи неструктурных белковых продуктов (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5), наблюдаемых в инфицированных флавивирусами клетках, в том числе и при репликации ВКЭ. 

Низкомолекулярные белки NS2A, NS2B, NS4A и NS4B с М 24873, 14531, 16063 и 27585 Da, соответственно, — это гидрофобные белки с протяженными участками остатков незаряженных аминокислот. Функции этих молекул в развитии вируса в клетках только выясняются. Более высокомолекулярные белки NS1, NS3 и NS5 легко обнаруживаются в инфицированных флавивирусами клетках, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости больных клещевым энцефалитом. 

Нестуктурный белок NS1 (M 39162 Da) является гликопротеином и обладает иммуногенными свойствами. Комплекс белка NS1 с гликопротеином Е отсутствует в зараженных клетках, несмотря на накопление индивидуальных составляющих его субъединиц, только секретируется в сыворотку крови [76]. Внеклеточная локализация комплекса на поздних стадиях инфекции исключает его участие в созревании вирионов и создает оптимальные условия для индукции синтеза вирусспецифических антител. Эти антитела способны вызвать комплемент-зависимый лизис инфицированных вирусом клеток. С другой стороны, фрагменты белка NS1 экспонируются на поверхности инфицированных ВКЭ клеток и индуцируют эффекторные CTL клеточного иммунитета. Предварительная иммунизация животных белком NS1 ВКЭ, вирусов лихорадки Денге и желтой лихорадки приводит к защите животных от высоких доз заражения этими вирусами. Однако, в сыворотке крови животных, иммунизированных NS1 ВКЭ, не обнаруживают вируснейтрализующих антител. Известно, что мутации в NS1 влияют на вирулентность флавивирусов. Предполагается, что NS1 также воздействует на ранние процессы репликации. В инфицированной клетке этот белок обнаруживается в димерной форме, либо во фракции белка с М 49000 Da. Последняя, по-видимому, представляет собой слитую форму 
NS1-NS2A, которая за счет гидрофобности цепи NS2A приобретает способность удерживаться на клеточных мембранах.

Второй крупный неструктурный белок NS3 (68949 Da), возможно, обладает протеазной, геликазной и рибо-НTФ-азной активностями. В составе третьего крупного неструктурного белка NS5 (102639 Da) всех флавивирусов присутствует последовательность, характерная для РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов животных и растений: Gly-Asp-Asp. Белки NS3 и NS5, по-видимому, необходимы для репликации вирусной РНК, так как в зараженных клетках они находятся в околоядерной области в составе комплекса с репликативной формой вирусного генома. Ассоциация комплекса с мембранами эндоплазматического ретикулума хозяйских клеток исключает возможность контактов с системой иммунитета и обеспечивает репродукцию ВКЭ в организме. Изменение соотношения составляющих субъединиц комплекса может вызы­вать переключение синтеза РНК с цепей отрицательной полярности на цепи положительной полярности [76]. 

Разумеется, из всех белков ВКЭ более полно изучен структурный белок Е. 

4.3. Структура и функции белка Е 

Белок Е — главный, биологически наиболее значимый компонент внешней поверхности оболочки вириона. Он играет ключевую роль в процессах сборки вирусной частицы, в связывании вируса с клеточной поверхностью и последующем слиянии вирусной и клеточной мембран — определяет тропизм вируса. При сборке вириона нуклеокапсид вирусной частицы диаметром 
26–30 нм, состоящий из вирусной РНК и внутривирусного нуклеокапсидного белка С, заключается в липидный бислой, происходящий из плазматической мембраны клетки-хозяина и вирусных поверхностных белков preМ и Е. Таким образом, гликопротеин Е и белок preМ (после созревания и выхода вируса из клетки — белок М) включены в состав липопротеиновой оболочки вируса, однако, пространственно выступают на поверхности собранной вирусной частицы.При обработке очищенного вирусного препарата трипсином или детергентами белок Е ВКЭ легко отщепляется от поверхности вириона в растворимом состоянии. Сохраняющаяся при этом интактная структура белковой глобулы была изучена рентгеноструктурным анализом [72]. На рис. 3 представлена схема пространственной конфигурации полипротеинов димера поверхностного белка Е ВКЭ. Из полученных данных следует, что на поверхности вируса белок Е представляет собой отдельную объемную единицу, состоящую из комплекса двух молекул (димера) вирусного белка Е. При этом каждая молекула белка Е в димере представляет собой продолговатое образование, состоящее из трех структурных клубков-доменов (I–III), собранное определенным образом из единой полипептидной цепочки. Объемный каркас каждой мо­лекулы в виде трех структурных доменов белка Е жестко фиксируется шестью дисульфидными мостиками, образованными 12 цистеиновыми остатками в полипептидной цепи белковой молекулы. Абсолютная консервативность цистеиновых остатков в составе белка Е и высокая гомологичность профиля гидрофильности полипептида этого белка для всех флавивирусов предполагают одинаковую пространственную структуру поверхностного белка Е флавивирусов. Надмолекулярная димерная структура поверх­ностного белка вируса дополнительно поддерживается межмолекулярным взаимодействием двух объемно протяженных молекул, стянутых вместе по принципу голова-хвост или валетом. В результате получается объемная симметричная структура димера с общими размерами длиной 150Е, шириной 55Е и толщиной 30Е, где боковые по­верхности в основном формируются I и II парными доменами, а торцевые поверхности — доменами III и частично I двух, образующих белковый димер, молекул. Плоская структура димера располагается параллельно с поверхностью липидной бислойной мембраны вириона, и в результате, как считается, белок Е образует на поверхности вируса объемно-решетчатую сеть толщиной 30Е. 

Результаты рентгеноструктурного анализа подтверждаются данными визуализации вирионов флавивирусов методом электронной микроскопии. Выступающие на поверхности вириона свободные участки димера белка Е, состоящие из двух димерообразующих парных доменов I, II и дистальных доменов III, связывают нейтрализующие вирус иммунопротективные антитела. Не удивительно, что мутации, расположенные на поверхности димера, как будет рассмотрено ниже, могут иметь серьезные последствия в патогенезе инфекции.

С использованием набора моноклональных антител (МКА) изучены иммунохимические свойства и проведено картирование антигенных детерминант на димере белка Е. На рис. 3 показаны топологические связи, серологическая специфичность и функции отдельных эпитопов, представляемых различными клонами МКА против белка Е штамма Найдорф западного серотипа ВКЭ [15].

На основании метода конкурентного связывания МКА были определены три неперекрывающиеся антигенные домена А, В и С, каждый из которых состоит из нескольких эпитопов А1–А5, В1–В5 и С1–С6, которые проявляют различные функции и серологическую специфичность. Более того, МКА выявили три изолированных эпитопа вне антигенных доменов i1–i3. Домен А содержит не только перекрестно реагирующие между различными флавивирусами эпитопы А1 и А2, но также специфические к субтипам ВКЭ эпитопы А3 и А4. Большинство эпитопов антигенного домена В специфичны к вирусам комплекса клещевого энцефалита, тогда как домен С преимущественно содержит специфические к вирусным субтипам эпитопы. Вируснейтрализующую активность проявили МКА, соответствующие эпитопам А3, А4, А5, В1, В2, В4, В5, С1 и i2. Примечательно, что эпитопы внутри каждого антигенного домена показывали одинаковые структурные свойства: чувствительность к денатурации при низких рН, протеолизу и восстановлению дисульфидной связи. Это, несомненно, подтверждает, что антигенные домены соответствуют хорошо известным стуктурным доменам белка Е.

Семь из вышеназванных эпитопов, в которых точечные мутации замещения аминокислотных остатков ведут к потере нейтрализации вируса соответствующими МКА (escape mutations), сосредоточены в двух больших не перекрывающихся участках, антигенных доменах С и А, соответствующих пространственным доменам I и II белка Е. Антигенные домены разобщены не только пространственно, но и отличаются по их чувствительности к конформационным изменениям и фрагментации. Оба антигенно реактивных участка вовлекаются в реакции нейтрализации вируса, но домен А содержит так называемые конформационные антигены, тогда как домен В — антигены, резистентные к конформационным изменениям и денатурации. Антигенный домен В, соответствующий структурному домену III белка Е, представляет собой достаточно автономное образование. Он может быть отщеплен от остальной части белковой молекулы трипсиновой обработкой нативного вириона или синтезирован отдельно, как генно-инженерный продукт, экспрессией рекомбинантной ДНК. Однако, в обоих случаях ведущая к нейтрализации вируса иммунохимическая активность антигенного домена В реализуется только при сохранности дисульфидного мостика внутри соответствующего структурного домена III белка Е. Как предполагается авторами, не исключено, что представленные отдельные эпитопы МКА составляют только части центров связывания нейтрализующих антител, составленных из фрагментов различных субъединиц белка на нативной структуре поверхности вириона. Хотя отсутствует специальное подтверждение, но часть центров нейтрализации вируса на белке Е, возможно, потеряна при получении солюбилизированного димера.

Локализация антигенных доменов на полипептидной карте белка Е показала, что структурный домен I образован N-концевыми 50 а.о. полипептида вместе с фрагментом 125–200 а.о., содержащим сайт гликозилирования белка Е, и другим фрагментом 250–300 а.о. Внутренние фрагменты полипептида 50–125 и 
200–250 а.о. образуют домен II белка Е. Следующие около 100 (301–395) а.о. полипептида белка Е составляют структурный домен III. Последние 50 а.о. с самого С-конца полипептида составляют якорную цепочку белка Е в бислойной липидной мембране вириона.

Белок Е штамма Софьин дальневосточного генотипа и серотипа ВКЭ, по данным работы [16], образует также три функционально гетерогенных антигенных домена Е1–Е3. Еще два изолированных эпитопа не входят в домены Е1–Е3. Эпитопная карта белка Е ВКЭ штамма Минск-256 (европейский генотип) содержит два основных домена Е1, Е2, и два эпитопа изолированы от остальных. Наибольшее отличие состоит в том, что домены Е1 и Е2 перекрываются через МКА 2Н3 и 13D6, а также наблюдаются «перестановки» эпитопов 1А2 и 1Н11, 14D5 и 13D6 в доменах Е1 и Е2, соответственно. Домен Е3 и изолированные эпитопы остаются без изменений. У штамма Софьин эпитопы, участвующие в нейтрализации вируса, в доменах Е1 и Е2, соответственно, образуют один основной сайт. По модели Heinz у вируса штамма Найдорф все три основных домена содержат нейтрализующие эпитопы. У штамма Софьин основные эпитопы нейтрализации вируса расположены в районе 375–471 а.о. линейной карты белка Е. В этом районе белка Е локализованы домены нейтрализации и других флавивирусов: вируса японского энцефалита (303–396 а.о.), вируса энцефалита долины Мюррей (390 а.о.), вируса лихорадки Денге (280–414 а.о.).

Таким образом, эпитопное картирование белка Е различных штаммов ВКЭ при помощи различных авторских серий МКА к этому белку, в общем случае, согласуется с выше обсуждавшимися результатами структурных исследований димерного комплекса этого белка штамма Найдорф, с трехдоменным объемным представлением о нем. Идентификация иммуноактивных участков белка Е ВКЭ штамма Софьин с помощью его синтетических пептидных фрагментов показала [47, 48]: антитела к пептидным фрагментам белка Е в поз.98–113 и 394–403 а.о. являются вируснейтрализующими; пептид, соответствующий а.о. белка Е 35–51, является частью конформационно зависимого В-эпитопа белка Е; в ряду потенциальных Т-эпитопов выявлены пептиды 48–74, 90–113, 204–224, 275–302 и 377–403, иммуногенные в свободном виде без коньюгации с белком-носителем и содержащие Т-хелперные эпитопы; пептиды 204–224, 275–302 и 377–403 способны эффективно связываться с противовирусной сывороткой человека и входят в состав В-эпитопов вируса; по ингибированию слияния вируса с макрофагами, липосомами и с применением МКА установлено, что полипептидный фрагмент белка Е 98–113 является участком слияния ВКЭ с эндосомальной мембраной клетки-хозяина. По мнению авторов работы [15], полипептидный фрагмент 398–413 а.о. белка Е ВКЭ, вирусов Западного Нила, DEN-2 и желтой лихорадки по характерному профилю своей гидрофобности соответствует иммунодоминантному Т-клеточному сайту. Таким образом, белок Е флавивирусов по своим структурно-функциональным свойствам определяет не только тропизм вируса, но также играет, по-видимому, во многом ключевую роль в вирулентности вируса, развитии гуморального и клеточного иммунитета.

4.4. Репликативный цикл флавивирусов

ВКЭ характеризуется широким клеточным тропизмом и может размножаться in vitro во многих клеточных линиях млекопитающих, членистоногих и птиц. Однако, не только у ВКЭ, но также у всех флавивирусов связывание вируса с поверхностью пермиссивных клеток и начальные события вирус-клеточного взаимодействия до сих пор детально не изучены. При помощи антиидиотипических антител, имитирующих гемагглютинирующие эпитопы белка Е, показано, что в качестве специфических рецепторов ВКЭ на поверхности клеток может выступить ламининовый рецептор человека [57]. Также предполагается, что в организме сорбция и дальнейшее необратимое связывание вириона с клеткой может быть опосредовано С3 компонентом комплемента, Fc детерминантой иммуноглобулинов или с участием специфических антител, когда уровни их концентрации ниже, чем нейтрализующие титры [40]. После прикрепления к клеточной поверхности вирионы флавивирусов локализуются во впячиваниях клеточной мембраны, где они подвергаются эндоцитозу с образованием эндоцитозных везикул (пузырьков). Иногда может наблюдаться и прямое слияние мембран. Детальные механизмы процессов раздевания вируса, трансляции внедренной в клетку вирусной РНК в вирусный полипротеин с процессингом протеазами в структурные и неструктурные вирусные белки, репликации вирусной геномной РНК, сборки нового нуклеокапсида и формирования зрелого, инфекционного вириона с участием клеточных компонентов и структур пока не исследованы.

Предполагаемая схема внутриклеточного жизненного цикла флавивирусов представлена на рис. 4 [41]. После стадий связывания с клеткой, эндоцитоза вирионов, слияния и расплавления мембран происходит раздевание нуклеокапсида и освобождение геномной РНК в цитоплазме. Далее следуют сложные совмещенные стадии трансляции и процессинга полипротеина (синтеза структурных и неструктурных вирусных белков) с ассоциированной с мембраной репликацией — размножением (+)- и (–)-цепей новой вирусной РНК. Затем вновь синтезированная (+)-цепь вирусной РНК комплексуется с preM, M и С-белками в вирусный нуклеокапсид. Дальнейшая сборка вириона с участием поверхностного Е белка и созревание полного инфекционного вируса происходят в клеточных структурах и окончательно завершаются в процессе транспортировки вирусов через клеточную мембрану. Вирионы созревают по мере передвижения из шероховатого эндоплазматического ретикулума в гладкий, затем в аппарат Гольджи и, наконец, в плазматическую мембрану клетки.

Созревание вируса с повышением его инфекционной активности также связывают с делеционным расщеплением preM белка с образованием структурного белка М зрелого вириона ВКЭ. Это расщепление встречается перед самым высвобождением вириона из клетки или одновременно с процессом транспортировки вириона через клеточную мембрану (Рис. 5). Как предполагается, антитела к preM белку могут способствовать протективному иммунитету путем нейтрализации содержащих preM-антиген вирионов, находящихся на клеточной поверхности.

При инфицировании флавивирусами некоторых линий клеток позвоночных наблюдается образование дефектных вирусных частиц с неполным геномом или с нарушенным порядком расположения генов в геномной РНК, так называемых дефектных интерферирующих вирусных частиц, секретируемых в возрастающих концентрациях с ростом числа пассажей. Синтез интерферирующих частиц характерен для персистентной хронической инфекции. Как было показано, у мышиной линии, резистентной к флавивирусной инфекции, это свойство придается наличием одиночного аутосомально-доминантного локуса в геноме, названного Flv и картированного на пятой хромосоме [40,74]. В инфицированной культуре первичных фибробластов от резистентной мыши синтез вирусной РНК ограничен, титр инфекционного вируса низок, а доля дефектных интерферирующих частиц значительна в результате только одного пассажа. Флавивирусы могут реплицироваться в организме резистентной мыши, но развитие инфекции замедлено, максимальная виремия на 3–4 порядка ниже, чем у нормальной мыши [41]. Эти эксперименты показали, что до сих пор не идентифицированный специфический хозяйский ген может драматически влиять на синтез флавивирусной РНК, на характер репликации вируса в клетке. Однако, в какой степени аналогичный механизм подавления репликативной инфекции может реализоваться в частном случае широко распространенного персистентного клещевого энцефалита у человека, пока не исследовано.

Новая информация, расскрывающая связь между механизмом репликации вируса в инфицированной клетке и патогенезом инфекции клещевого энцефалита получена Морозовой О.В. в результате изучения репликативного комплекса ВКЭ с участием клеточных и вирусных неструктурных белков NS5, NS3 и вирусной РНК. На основании полученных результатов предполагается, что РНК-зависимый синтез может регулироваться при помощи изменения состава внутриклеточного комплекса вирусных и клеточных белков. Выход белка NS5 из состава комплекса приводит к нормальному переключению синтеза с «минус»-цепей РНК на геномные РНК и, следовательно, к развитию репликативной инфекции. Уменьшение относительных количеств белка NS3 в составе ассоциированного с мембранами комплекса вирусных белков, возможно, ингибирует скорость синтеза геномных РНК, что приводит к реализации процесса медленной персистентной инфекции [76].

Клетки, инфицированные флавивирусами, кроме зрелых и дефектных вирусных частиц также секретируют медленно седиментирующие частицы с внешним размером 14 нм, состоящие из корпускулярных агрегатов Е и М белков вируса. Как показано, эти неинфекционные частицы вирусного происхождения являются эффективными иммуногенами в синтезе антител с нейтрализующими вирус, протективными свойствами.

В инфицированных флавивирусами клетках происходят хорошо заметные ультраструктурные изменения, включая вакуолизацию, пролиферацию внутриклеточных мембран. Инфекция часто цитоцидна, хотя часть клеток сохраняется и, таким образом, становится хронически инфицированной. Даже на стадии максимальной репликации вируса значительного ингибирования синтеза клеточных макромолекул не наблюдается.

Кроме человека, ВКЭ также высокопатогенен для обезьян и белых мышей. Малочувствительны к нему кролики, морские свинки. В экспериментальной инфекции наряду с высокочувствительной и низкочувствительной моделями белой мыши и морской свинки промежуточную позицию по чувствительности к развитию нейропатологии клещевого энцефалита занимают сирийские хомячки. Из домашних животных к инфекции клещевого энцефалита восприимчивы поросята и овцы. Козы и коровы также инфициируются ВКЭ, однако инфекция часто ограничивается кратковременной вирусемией с проникновением вируса в молоко животных [2, 3, 41]. В результате нападения клещей в организме теплокровных животных развиваются специфические защитные реакции и при повторном присасывании клещей к иммунным животным у паразитов могут резко нарушаться процессы насыщения и наступить их гибель [53].

5. Молекулярно-генетическая неоднородность и патогенность вируса клещевого энцефалита

5.1. Генотипы и серотипы вируса 

По результатам РТГА антигенные группы флавивирусов были разделены на 8 родственных комплексов или групп. Вне этих групп также к флавивирусам относится вирус желтой лихорадки. В первый из комплексов — антигенный комплекс вирусов клещевого энцефалита — входят: вирусы клещевого энцефалита, омской геморрагической лихорадки, кьясанурской лесной болезни, Louping ill (шотландского энцефаломиелита овец), Лангат, Повассан, Негиши, Карши и Royal Farm [41]. По результатам генотипи­рования штаммов ВКЭ штамм Вергина, считавшийся одним из штаммов ВКЭ, кластеризуется с вирусами комплекса клещевого энцефалита греческого и турецкого энцефаломиелита овец и, по-видимому, не является собственно вирусом клещевого энцефалита [78].

В ряде первых работ уровень гомологии и генетические взаимоотношения штаммов ВКЭ изучались методом генотипирования с применением двух типов зондов: кДНК-зонда, представляющего собой комплементарные копии трех фрагментов геномной РНК ВКЭ штамма Софьин в составе рекомбинантных плазмид, суммарно пре­крывающих около половины вирусного генома со стороны 5’-конца, а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов длиной 18–26 нуклеотидов, комплементарных различным участкам РНК ВКЭ. Кроме того, использовали два олигонуклеотидных зонда, специфичных для западного штамма Найдорф. На основании способности РНК 143-х штаммов ВКЭ гибридизоваться с перечисленными зондами был разработан критерий отнесения каждого штамма вируса к одному из шести условно выделенных генетических вариантов вируса.

Генетическую вариабельность природных популяций ВКЭ изучали с помощью коллекции из 200 штаммов, изолированных из различных эндемичных районов бывшего Советского Союза — от Приморья на востоке до Западной Украины и Калининградской области на западе, Крыма и Киргизии на юге. Оказалось, что установленные методом молекулярной эпидемиологии с применением ДНК-зондов те или иные варианты вируса циркулируют на разных, иногда весьма отдаленных друг от друга территориях или имеют смешанные совместные места распространения. Было показано, что штаммы, подобные прототипному штамму Софьин дальневосточного подтипа, составляли всего 16 % изученной коллекции и встречались преимущественно на Дальнем Востоке, реже — в западной части обследованного ареала и совсем редко — в Сибири и на Урале. Также выявлено, что штаммы, обладающие некоторыми геномными последовательностями, характерными для европейского штамма Найдорф, распространены на восток, по крайней мере, до территории Западной Сибири [9–13, 24, 52].

В другой работе Злобин В.И. с соавторами для генотипирования ВКЭ получали кДНК-копии фрагмента гена Е длиной 160 нуклеотидов, используя ПЦР с необходимыми специфическими праймерами. Полученные фрагменты секвенировали и оценивали уровни гомологии. При различиях нуклеотидных последовательностей между двумя штаммами в 12% и более их относили к двум разным генотипам. Анализ гомологии фрагмента гена Е 35 штаммов ВКЭ, изолированных в различных участках ареала, пока­зал, что они могут быть разделены также на 6 геноти-пов [56].

Продолжение следует...